Formål
I dette forsøg undersøges enzymet amylases aktivitet. Specielt vil vi efterligne miljøet i Ikka-søjlerne og undersøge hvilken effekt lav temperatur og høj pH har på enzymaktiviteten.

Teori
Da forskerne undersøgte bakterier fra Ikka-søjlerne nærmere, viste nogle af dem tegn på at indeholde enzymet amylase, der kan spalte stivelse. Stivelse er et kulhydrat opbygget af flere hundrede glukosemolekyler i lange kæder, man kalder det et polysakkarid. Det udgør langt størstedelen af kulhydraterne i vores og i mange bakteriers kost.

Amylase spalter stivelse til disakkaridet maltose, som blot består af to glukosemolekyler. Mange bakterier udskiller amylase for netop at nedbryde de store stivelsesmolekyler til små molekyler, der lettere kan optages. Mennesker udskiller også amylase både i munden, hvor spytkirtlerne udskiller spytamylase, og i tolvfingertarmen, hvor bugspytamylase tilføres fra bugspytkirtlen.

Desværre har man endnu ikke udvundet amylase fra Ikka-bakterier. I forsøget benyttes derfor spytamylase (fra vores mundhule) og industriel amylase til at nedbryde stivelse.

Vi vil undersøge aktiviteten af enzymerne ved normal stuetemperatur og neutral pH, men også ved lav temperatur og høj pH for at efterligne miljøet i Ikka-søjlerne.

Man kan påvise spaltningen af stivelse via et farveskift. Det sker ved at tilføre en jodforbindelse, som binder til stivelsesmolekylerne og farver dem blå. Når stivelsen bliver nedbrudt til mindre enheder, forsvinder væskens blålige skær. I stedet bliver væsken gullig pga. de frigjorte jod-ioner. Det er dette farveskift og hastigheden heraf, som bruges som udtryk for amylaseaktiviteten og dermed spaltningen af stivelse.

Hypotese
Når du har læst fremgangsmåden, men inden du går i gang med forsøget, opstil da en hypotese, hvor du skitserer og forklarer dine forventede resultater. Overvej i den forbindelse, om det i glassene med de ekstreme temperatur- og pH-forhold kan have betydning for resultaterne, at det ikke er enzymer fra Ikka-søjler, vi anvender.

Materialer
• Bægerglas med ca. 100 mL 0,5 % forklistret stivelsesopløsning. (En fælles opløsning laves ved at opslæmme 5 gram stivelse i lidt vand og derefter med kogende vand fortynde til en liter).
• Reagensglas med 5 % jod-jod-kaliumopløsning (Lugols reagens).
• Lille bægerglas med industriel amylase (AMG-300).
• 1 mM NaOH opløsning
• Lille bægerglas til opsamling af spytamylase.
• 5 reagensglas i stativ + et tomt stativ.
• 10 mL måleglas, spatel til omrøring, 2 engangspipetter, vandfast tusch, mærkater og ur.

Fremgangsmåde

1. Hver gruppe indsamler de nævnte materialer.
2. En person fra hver gruppe opsamler ca. 2-3 mL spyt i et lille bæger¬glas, evt. ved at tygge på en elastik. Spyttet fortyndes med ca. 4 mL vand og omrøres grundigt.
3. Fem reagensglas nummereres fra 1-5, svarende til følgende forsøg:

4. Ved hjælp af 10 mL måleglas tilsættes til alle fem forsøgsglas 5 mL 0,5 % stivelseopløsning.
5. Tilsæt 2 dråber jod-jod-kalium med engangspipette til hvert glas og omrør med spatel. Notér farvereaktionen og hold øje med om farven skifter i glas nr. 1 (kontrol = blindprøve). Spatlen skylles omhyggeligt inden I fortsætter.
6. Tilsæt 0,5 mL spytamylase til glas 2 og omrør med spatel. Tag omhyggeligt tid på hvor lang tid der går før væsken bliver klar med svagt blåligt skær. Farvereak¬tionen iagttages bedst ved at holde glasset op mod et hvidt papir sammen med glas 1. Husk at skylle spatlen inden næste forsøg.
7. Til glas 3 tilsættes 3 dråber AMG-300 (industriel amylase) med plasticpipette, omrør med spatlen. Tag igen omhyggeligt tid på farveskiftet (ligesom i glas 2, punkt 6).
8. Temperaturforsøg (glas 4): Anbring glas 4 i køleskab i 5 minutter. Tilsæt derefter 3 dråber AMG 300 og omrør med rengjort spatel. Tag igen omhyggeligt tid på farveskiftet og notér tiden.
9. pH-forsøg (glas 5): Tilsæt 0,5 mL 1 mM NaOH med plasticpipette til glas 5, derefter 3 dråber AMG 300 og omrør med rengjort spatel. Hold igen øje med farveskiftet som i de andre forsøg.
10. Hvis der er tid udføres flere forsøg med enten ændret pH eller temperatur. Prøv f.eks. at tilsætte 0,5 ml 0,1M saltsyre. Det giver et pH på 2 hvad sker der?.
11. Alle rydder op. Glas med stivelsesopløsning renses omhyggeligt med reagensglasbørste, varmt vand og sæbe. Øvrige glas rengøres også med varmt vand og sæbe, og alle glas skylles til sidst med demineraliseret vand og stilles på viskestykke med bunden i vejret. Det rengjorte udstyr skal godkendes af læreren. Alternativt sættes det hele i opvaskemaskinen.

Resultater
Udfyld resultatskemaet med tiderne for farveskift.

Diskussion
Forklar hvad hvert af de fem forsøg viser om spaltning af stivelse ved hjælp af amylase, herunder:

Konklusion
Skriv en kort konklusion på forsøget i forhold til formålet med det.

Perspektiv
Hvilke anvendelsesmuligheder er der for enzymer, der er aktive under ekstreme forhold?